TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（綠色熒光）

其原理是在末端脫氧核糖核苷酸轉移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）的作用下✘╃·☁，在基因組DNA斷裂時暴露出的3´-羥基（3´-OH）末端摻入被Alexa Fluor 488染料標誌的dUTP✘╃·☁，使凋亡的細胞被標誌上綠色熒光✘╃·☁，從而可以用熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測·╃╃。

本試劑盒為直接熒光標誌法的TUNEL染色✘╃·☁，染色步驟簡便✘╃·☁，應用範圍廣泛✘╃·☁，可用於檢測冰凍切片▩╃、石蠟切片和培養細胞的凋亡情況·╃╃。
包裝清單•·：

TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒產品組成•·：

儲存條件•·：

-20 ℃儲存✘╃·☁，一年有效·╃╃。

操作步驟•·：

1▩╃、樣本處理•·：

a) 石蠟切片•·：經二甲笨▩╃、酒精脫蠟✘╃·☁，覆水·╃╃。脫蠟應充分·╃╃。

b) 冰凍切片•·：流水沖洗✘╃·☁，去除OCT包埋膠後✘╃·☁，用純水洗3次·╃╃。

c) 細胞飛片•·：用組織固定液固定後✘╃·☁，用PBS洗三次✘╃·☁，每次5分鐘·╃╃。1% Triton X-100處理10分鐘✘╃·☁，用PBS洗三次✘╃·☁，每次5分鐘·╃╃。

2▩╃、蛋白酶消化

將1ul 試劑（A）50× Proteinase K稀釋於50ul PBS中✘╃·☁，滴加到組織上✘╃·☁，37℃孵育10-20分鐘·╃╃。消化結束後✘╃·☁，用PBS洗三次✘╃·☁，每次5分鐘·╃╃。

3▩╃、陽性對照組織的處理

將組織用DNase I消化✘╃·☁，以獲得斷裂的DNA✘╃·☁，即成Tunel染色陽性的對照·╃╃。陽性對照組織也可以選用小鼠的小腸組織切片·╃╃。

將50 ul DNase I消化液滴加於組織上✘╃·☁，37℃孵育10-30分鐘✘╃·☁，消化結束後✘╃·☁，用PBS洗三次✘╃·☁，每次5分鐘·╃╃。

4▩╃、Tunel標誌染色:

Tunel標誌染色前用50 ul Equilibration Buffer孵育標本5-10分鐘·╃╃。孵育過程中按下表配製Tunel染色工作液·╃╃。去除標本上的Equilibration Buffer後✘╃·☁，直接滴加50ul Tunel染色液✘╃·☁，37℃孵育1-2小時✘╃·☁，染色結束後✘╃·☁，用PBS洗三次✘╃·☁，每次5分鐘·╃╃。

5▩╃、封片•·：

每組織上滴加一滴封劑✘╃·☁，小心蓋上蓋玻片✘╃·☁，避免產生氣泡·╃╃。用吸水紙吸去多餘的封片劑·╃╃。熒光顯微鏡下觀察·╃╃。

注意事項•·：

1▩╃、Proteinase K 消化時間需要摸索✘╃·☁，冰凍切片 10 min 左右✘╃·☁，石蠟切片時間應適當延長·╃╃。

2▩╃、陰性對照體系•·：配製Tunel染色工作液時用純水替代TdT Enzyme·╃╃。

3▩╃、懸浮細胞用離心的方法收集細胞✘╃·☁，所有反應在離心管中進行✘╃·☁，染色結束後✘╃·☁，可在熒光顯微下觀察✘╃·☁，也可以用流式細胞儀檢測·╃╃。

4▩╃、Tunel標誌染色時應注意避光·╃╃。

5▩╃、實驗過程中請穿戴手套▩╃、實驗服等✘╃·☁，做好個人防護·╃╃。