TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（DAB顯色法）

其原理是在末端脫氧核糖核苷酸轉移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）的作用下◕✘·▩₪，在基因組DNA斷裂時暴露出的3´-羥基（3´-OH）末端摻入生物素（Biotin）標誌的dUTP◕✘·▩₪，隨後透過Biotin與連線辣根過氧化酶的鏈黴親和素（Streptavidin-HRP）特異結合◕✘·▩₪，在辣根過氧化酶底物二氨基聯苯胺（DAB）的存在下◕✘·▩₪，產生深棕色的不溶物◕✘·▩₪，從而特異準確地定位凋亡的細胞↟◕·。

本試劑盒可用於石蠟切片▩•▩✘•、冰凍切片和細胞樣本（細胞塗片或爬片）的凋亡原位檢測◕✘·▩₪，檢測結果可在普通光學顯微鏡下直接觀察計數↟◕·。
包裝清單▩•↟：

產品組成▩•↟：

儲存條件▩•↟：

Streptavidin-HRP, 4℃, 其餘試劑-20 ℃儲存◕✘·▩₪，一年有效↟◕·。

操作步驟▩•↟：

1▩•▩✘•、樣本處理▩•↟：

a) 石蠟切片▩•↟：經二甲笨▩•▩✘•、酒精脫蠟◕✘·▩₪，覆水↟◕·。脫蠟應充分↟◕·。

b) 冰凍切片▩•↟：流水沖洗◕✘·▩₪，去除OCT包埋膠後◕✘·▩₪，用純水洗3次↟◕·。

c) 細胞飛片▩•↟：用組織固定液固定後◕✘·▩₪，用PBS洗三次◕✘·▩₪，每次5分鐘↟◕·。1% Triton X-100處理10分鐘◕✘·▩₪，用PBS洗三次◕✘·▩₪，每次5分鐘↟◕·。

2▩•▩✘•、蛋白酶消化

將1ul 試劑（A）50× Proteinase K稀釋於50ul PBS中◕✘·▩₪，滴加到組織上◕✘·▩₪，37℃孵育10-20分鐘↟◕·。消化結束後◕✘·▩₪，用PBS洗三次◕✘·▩₪，每次5分鐘↟◕·。

3▩•▩✘•、封閉

用3%的雙氧水（H2O2）室溫封閉10分鐘◕✘·▩₪，封閉結束後用PBS洗三次◕✘·▩₪，每次5分鐘↟◕·。

4▩•▩✘•、陽性對照組織的處理

將組織用DNase I消化◕✘·▩₪，以獲得斷裂的DNA◕✘·▩₪，即成Tunel染色陽性的對照↟◕·。陽性對照組織也可以選用小鼠的小腸組織切片↟◕·。

將50 ul DNase I消化液滴加於組織上◕✘·▩₪，37℃孵育10-30分鐘◕✘·▩₪，消化結束後◕✘·▩₪，用PBS洗三次◕✘·▩₪，每次5分鐘↟◕·。

5▩•▩✘•、連線:

連線反應前用50 ul Equilibration Buffer孵育標本5-10分鐘↟◕·。孵育過程中按下表配製連線工作液↟◕·。去除標本上的Equilibration Buffer後◕✘·▩₪，直接滴加50ul 連線工作液◕✘·▩₪，37℃孵育1-2小時◕✘·▩₪，染色結束後◕✘·▩₪，用PBS洗三次◕✘·▩₪，每次5分鐘↟◕·。

6▩•▩✘•、標誌

取1 ul 試劑（I）Streptavidin-HRP加入到50ul PBS 中◕✘·▩₪，混勻後滴加至組織上◕✘·▩₪，37℃避光孵育30分鐘◕✘·▩₪，隨後用PBS洗三次◕✘·▩₪，每次5分鐘↟◕·。

7▩•▩✘•、顯色

取50 ul 試劑（J）DAB-A solution 與2.5 ul 試劑（K）DAB-B solution混勻後◕✘·▩₪，滴加至組織上◕✘·▩₪，室溫顯色反應30秒至5分鐘↟◕·。顯色結束後◕✘·▩₪，用PBS洗三次◕✘·▩₪，每次5分鐘

8▩•▩✘•、蘇木素復染

每組織上滴加數滴Mayer’s蘇木素染色液◕✘·▩₪，染色1-5分鐘◕✘·▩₪，隨後用自來水沖洗反藍◕✘·▩₪，如蘇木素染色過深◕✘·▩₪，可用1%鹽酸酒精溶液分化數秒◕✘·▩₪，再次反藍；如蘇木素染色過淺◕✘·▩₪，可用蘇木素再次染色◕✘·▩₪，並延長染色時間↟◕·。

9▩•▩✘•、封片觀察

經梯度酒精脫水◕✘·▩₪，二甲苯透明後◕✘·▩₪，滴加中性樹膠◕✘·▩₪，加蓋玻片封片◕✘·▩₪，光學顯微鏡下觀察拍照↟◕·。

注意事項▩•↟：

1▩•▩✘•、Proteinase K 消化時間需要摸索◕✘·▩₪，冰凍切片 10 min 左右◕✘·▩₪，石蠟切片時間應適當延長↟◕·。

2▩•▩✘•、陰性對照體系▩•↟：配製連線工作液時用純水替代TdT Enzyme↟◕·。

3▩•▩✘•、連線與標誌反應時應注意避光↟◕·。

4▩•▩✘•、實驗過程中請穿戴手套▩•▩✘•、實驗服等◕✘·▩₪，做好個人防護↟◕·。

備註▩•↟：

         產品資訊可能會有最佳化升級◕✘·▩₪，請以實際標籤資訊為準↟◕·。

本產品僅供科研使用↟◕·。請勿用於醫藥▩•▩✘•、臨床診斷或治療◕✘·▩₪，食品及化妝品等用途↟◕·。請勿存放於普通住宅區↟◕·。

為了您的安全和健康◕✘·▩₪，請在實驗過程中做好防護工作↟◕·。